MAKALAH PENELITIAN KONSUMSI DARK CHOCOLATE

BAB I

PENDAHULUAN

Coklat mengandung berbagai macam senyawa  yang bervariasi jenisnya, seperti lemak jenuh, polifenol, sterol, di- dan triterpen, alkohol alifatik, dan metilxantin (Knight, I., et al., 2000). Kokoa, komposisi utama dari coklat, kaya akan senyawa polifenol, terutama sekali flavan-3-ols, seperti epicatechin, catechin, dan procyandin (Scalbert, A., et al., 2000). Senyawa polifenol secara luas terdistribusi dalam sayuran, buah-buahan, dan pada minuman seperti teh, yang dikonsumsi kebanyakan orang setiap harinya (Scalbert, A., et al., 2000). Dari studi epidemiological diperoleh fakta bahwa asupan makanan yang mengandung banyak flavanoid, senyawa turunan polifenol, dapat menguarangi resiko terkena penyakit jantung koroner (Hertog, M.G. L., et al., 1995). Hal ini disebabkan flavanoid dapat berperan sebagai antioksidan (Fuhrman, B., et al., 2001). Modifikasi oksidatif LDL memegang peran penting dalam atherogenesis (Steinberg, D., et al., 1989), dan agen yang mampu mencegah oksidasi LDL pada dinding arteri bisa memperlambat serangan atherosclerosis (Fuhrman, B., et al., 2001).

Bubuk kokoa dan coklat memiliki potensi sebagai antioksidan dan dapat menginhibisi oksidasi LDL secara invitro (Kondo, K., et al., 1996). Studi sebelumnya menunjukkan bahwa coklat dapat meningkatkan kapasitas antioksidan di dalam plasma (Serafini, M., et al., 2003), menurunkan kereaktifan formasi asam 2-thiobarbituric dalam plasma (Rein, K., et al., 1996), dan menginhibisi oksidasi LDL secara ex vivo (Kondo, K., et al., 1996). Dewasa ini telah diketahui bahwa dengan mengkonsumsi polifenol kokoa untuk jangka waktu yang panjang juga dapat meningkatkan kapasitas antioksidan di dalam plasma dan menginhibisi oksidasi LDL secara ex vivo (Wan, Y., et al., 2000). Namun penelitian yang berhubungan langsung dengan efek jangka panjang konsumsi coklat terhadap peroksidasi lipid secara in vivo sangat langka (Mathur, S., et al., 2002).

Seringkali coklat dipostulatkan memiliki efek hypercholesterolemic karena memiliki kandungan lemak jenuh sangat tinggi. Namun hasil penelitian secara klinis

menunjukkan bahwa konsumsi coklat tidak memiliki efek terhadap jumlah serum total dan kolesterol LDL (Kris-Etherton, P.M., et al., 1994). Sedangkan konsumsi kokoa atau dark chocolate mungkin dapat memberikan keuntungan pada serum lipid. Penelitian dewasa ini menunjukkan bahwa mengkonsumsi dark chocolate dapat meningkatkan konsentrasi kolesterol HDL sebesar 4% (Wan, Y., et al., 2001).

Komsumsi coklat dapat memberikan efek pada peroksidasi lipid secara ex vivo telah diketahui, namun penelitian tentang efek jangka panjang konsumsi coklat terhadap peroksidasi lipid secara in vivo belum ada publikasi. Selain itu, penelitian sebelumnya tidak menjawab pertanyaan tentang perubahan konsentrasi HDL yang berhubungan dengan asam lemak dari coklat atau kokoa itu sendiri. Sehingga hal ini mendorong pengadaan penelitian klinis untuk mempelajari efek mengkonsumsi coklat dalam jangka waktu yang lama terhadap serum lipid dan peroksidasi lipid secara ex vivo dan in vivo. Untuk membedakan antara efek polifenol dan asam lemak coklat dalam induksi peroksidasi lipid, maka coklat yang digunakan mengandung jumlah asam lemak yang sama, namun berbeda dalam jumlah kandungan polifenol.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sejarah Singkat Coklat

Coklat sering disebut sebagai makanan psikoaktif. Coklat atau kakao merupakan tanaman perkebunan berupa pohon yang dikenal di Indonesia sejak tahun 1560, namun baru menjadi komoditi yang penting sejak tahun 1951. Coklat yang dapat dijumpai saat ini merupakan hasil olahan dari biji buah cokelat atau disebut buah kakao dengan nama latin Theobroma cacao L. Sesuai namanya, Theobroma artinya makanan atau santapan dewa. Berasal dari bahasa Yunani, Theos yang artinya dewa dan broma yang artinya makanan. Pohon kokoa merupakan tanaman asli dari hutan tropis Amazon yang memiliki kelembapan sangat tinggi. Tetapi varietas lainnya juga bisa ditemukan di Meksiko dan Peru.

Klasifikasi botani tanaman kakao adalah sebagai berikut:

Divisi               : Spermatophyta

Sub divisi        : Angiospermae

Kelas               : Dicotyledonae

Famili              : Sterculiaceae

Genus              : Theobroma

Spesies            : Theobroma cacao L

Jenis kakao yang terbanyak dibudidayakan adalah jenis:

a)   Criollo (Criollo Amerika Tengah dan Amerika Selatan) yang menghasilkan biji  kakao bermutu sangat baik dan dikenal sebagai kakao mulia, fine flavour cocoa, choiced cocoa atau edel cocoa.

b)   Forastero yang menghasilkan biji kakao bermutu sedang dan dikenal sebagai ordinary cocoa atau bulk cocoa.

c)  Trinitario yang merupakan hibrida alami dari Criollo dan Forastero sehingga menghasilkan biji kakao yang dapat termasuk fine flavour cocoa atau bulk cocoa. Jenis Trinitario yang banyak ditanam di Indonesia adalah Hibrid Djati Runggo (DR) dan Uppertimazone Hybrida (Kakao lind).

Gambar 2.1 Pohon Kakao

 

2.2 Coklat dan Kandungan yang terdapat di Dalamnya

Kokoa atau coklat merupakan bahan makanan yang mengandung lebih dari 600 komponen. Coklat yang dikenal saat ini merupakan hasil olahan biji coklat yang dicampur dengan bubuk kokoa, gula, dan susu.  Coklat mengandung berbagai macam senyawa  yang bervariasi jenisnya, seperti lemak jenuh, polifenol, sterol, di- dan triterpen, alkohol alifatik, dan metilxantin (Knight, I., et al., 2000). Hal ini dapat menjelaskan bahwa secara alami coklat sangat kompleks. Berikut adalah komponen utama penyusun coklat (Nielsen, 1995):

• cocoa butter (54%)
• protein (11,5%)
• serat (3-10%)
• asam organik (9,5%)
• selulosa (9%)
• air (5%)
• garam mineral (2,6%)
• theobromin (1,2 %)
• gula (1%)
• kafein (0,2%)

Selain itu, di dalam coklat juga mengandung senyawa-senyawa bioaktif seperti flavonoid (terutama catechin dan procyanidin), metilxantin, anandamin dan polifenol serta turunannya. Beberapa senyawa bioaktif di dalam coklat ini secara teori dapat mempengaruhi emosi, kesehatan  dan kenyamanan pada orang yang memakannya. Seperti theobromin dan kafein yang berfungsi sebagai stimulan. Selain itu coklat juga mengandung tiramin dan feniletil amin, yang sifatnya mirip amfetamin, stimulan untuk sistem saraf pusat. Feniletil amin dapat meningkatkan serapan triptofan ke dalam otak yang kemudian akan menghasilkan dopamin. Dampak dopamin adalah munculnya perasaan senang dan perbaikan suasana hati. Tetapi, senyawa ini hanya sedikit terkandung di dalam coklat dan dapat ditemukan pula pada makanan lain yang dikonsumsi pada umumnya. Coklat juga mengandung triptofan. Triptofan merupakan asam amino esensial. Triptofan merupakan senyawa penentu laju produksi modulasi mood pada sistem saraf serotonin.

Kokoa dan coklat merupakan sumber antioksidan polifenol paling tinggi. Pada awalnya polifenol di dalam coklat hanya berperan di dalam memberikan cita rasa dan aroma pada coklat. Namun pada penelitian dewasa ini menunjukkan bahwa polifenol merupakan zat antioksidan yang memiliki kemungkinan menguntungkan bagi kesehatan manusia. Flavonoid dan polifenol juga mampu menurunkan tingkat kolesterol, mengurangi resiko tekanan darah tinggi, melindungi tubuh dari penyakit, serta mengurangi efek-efek penuaan, dan membersihkan radikal yang dapat merusak sel tubuh, akhirnya dapat mengakibatkan kanker.

2.2.1 Lipid

Lipid merupakan senyawa yang dapat menyediakan energi untuk aktivitas sehari-hari di dalam membantu untuk mensuplai nutrisi untuk tubuh. Coklat merupakan salah satu sumber minor dari lipid. Hampir 60% lemak biasanya berasal dari susu, keju, krim, daging, mentega, dan margarin (Gregory, J., et al., 1990). Meskipun pola konsumsi bervariasi untuk tiap negara, namun secara keseluruhan hampir sama. Penggolongan lipid:

·         Lipid sederhana, contohnya fats & oils, wax

·         Lipid kompleks, contohnya glikolipid, fosfolipid, lipoprotein

·         Turunan lipid, contohnya sterol, karotenoid, dan terpen.

Tetapi, ada penggolongan lipid lain yang dibedakan melalui kandungan asam lemaknya. Setidaknya ada tiga kelas utama lipid:

1. Saturated Fatty Acid (SFA)

Memiliki rantai linier, tidak ada ikatan rangkap. Pada temperatur kamar wujudnya adalah padat. Jenis lipid ini biasanya paling banyak ditemukan pada hewan. Namun lipid jenis ini dapat ditemukan pula pada minyak kelapa, minyak kelapa sawit, dan mentega. Makanan yang mengandung lipid jenis akan meningkatkan kadar kolesterol LDL dalam tubuh.

2. Polyunsaturated Fatty Acid (PUFA)

Suatu asam lemak yang memiliki dua atau lebih ikatan rangkap. Pada temperatur kamar wujudnya adalah cair. Kadar PUFA sangat tinggi pada minyak ikan, bunga matahari, jagung, dan minyak kedelai. Konsumsi PUFA dapat menurunkan kadar kolesterol LDL di dalam peredaran darah. Sehingga dapat membantu mencegah terkena penyakit jantung.

3. Monounsaturated Fatty Acid (MUFA)

Suatu asam lemak yang memiliki satu ikatan rangkap. MUFA dapat ditemukan pada minyak zaitun, kacang tanah, dan biji kanola. Berdasarkan penelitian, konsumsi MUFA dapat meningkatkan kadar kolesterol HDL dalam darah. Studi epidemologis pada penduduk Mediterania yang banyak mengkonsumsi zaitum menyimpulkan efek positif bagi kesehatan jantung.

50-57% biji coklat terdiri dari bubuk kakao, yang akan mempengaruhi titik leleh coklat. Bubuk kakao ini mengandung 34% asam stearat (18:0), 34% asam oleat (18:1), 25% asam palmitat (16:0), dan 2% asam linolenat (18:3) (Otton, et al., 1998).  

Pada umumnya, konsumsi SFA berhubungan dengan peningkatan resiko penyakit jantung koroner, karena kemampuan SFA di dalam meningakatkan jumlah lipid di dalam plasma dan lipoprotein. Selain itu, SFA juga dapat meningkatkan trombosis (Laioren, D., 1997). Sebaliknya, berdasarkan eksperimen diketahui bahwa Unsaturated Fatty Acid dapat menurunkan faktor aterogenik (Keys, A., et al., 1986). Hal inilah yang menyebabkan timbulnya anggapan bahwa tingginya kadar SFA dalam coklat dapat mengganggu sistem jantung. Asam stearat dan asam palmitat merupakan asam lemak paling utama pada total SFA yang dikonsumsi melalui daging. Meskipun asam stearat termasuk asam lemak jenuh (SFA), namun terbukti tidak meningkatkan kadar kolesterol di dalam tubuh, tidak seperti SFA yang lain. Seperti telah diketahui bahwa SFA dapat meningkatkan kadar kolesterol. Tetapi perkembangan penelitian menunjukkan bahwa rupanya tidak semua SFA memiliki efek hiperkolesterolemik (Denke, M. A., et al., 1994).

                                  

Gambar 2.2 Struktur asam oleat

Gambar 2.3 Struktur asam palmitat

Gambar 2.4 Struktur asam stearat

Berdasarkan fakta hasil penelitian (Mustad, V. A., et al., 2000), asam stearat adalah asam lemak yang unik. Tidak seperti asam lemak jenuh yang lain, asam sterat memiliki efek yang netral pada kadar kolesterol di dalam darah, yang sangat penting di dalam menjaga kesehatan jantung/kardiovaskular. Sifat dari asam stearat ini hampir sama dengan asam oleat (MUFA).

2.2.2 Polifenol dalam coklat

Kokoa, komposisi utama dari coklat, kaya akan senyawa polifenol, terutama sekali flavan-3-ols, seperti epicatechin, catechin, dan procyandin (Scalbert, A., et al., 2000). Senyawa polifenol secara luas terdistribusi dalam sayuran, buah-buahan, dan pada minuman seperti teh, yang dikonsumsi kebanyakan orang setiap harinya (Scalbert, A., et al., 2000).

Gambar 2.5 struktur catechin dan epicatechin

Gambar 2.6 struktur dimer procyanidin

Saat ini telah diidentifikasi setidaknya 8000 variasi senyawa polifenol. Polifenol merupakan substansi paling umum yang terdapat di dalam tumbuh-tumbuhan. Senyawa polifenol di dalam tumbuhan berperan di dalam menjalankan metabolisme, menyediakan predator untuk pertahanan hidup, membentuk warna yang sempurna untuk buah-buahan dan sayuran, dan mencegah pertumbuhan yang prematur. 

Kokoa dan coklat merupakan sumber antioksidan polifenol paling tinggi. Pada awalnya, polifenol di dalam coklat hanya berperan di dalam memberikan cita rasa dan aroma pada coklat. Namun, penelitian dewasa ini menunjukkan bahwa polifenol merupakan antioksidan yang memberikan keuntungan bagi kesehatan manusia. Kandungan polifenol paling tinggi terdapat pada kokoa, diikuti produk kokoa seperti dark chocolate dan milk chocolate. Berdasarkan eksperimen, di dalam 1,5 ons milk chocolate terdapat 205-300 mg polifenol. Sedangkan pada 5 ons anggur merah terdapat 210 mg polifenol. Jumlah polifenol di dalam coklat empat kali lebih banyak dibandingkan polifenol di dalam teh.

2.2.3 Flavonoid dalam coklat

Flavonoid merupakan senyawa turunan polifenol. Struktur dasar (kerangka utama) dari senyawa flavonoid adalah adanya dua cincin aromatik yang mengandung oksigen yang terhidrogenasi. Flavonoid dapat dibagi menjadi 13 kelas didasarkan atas hidroksilasi dan oksidasi pada cincin aromatik. Klasifikasi flavonoid contohnya adalah antosianin (senyawa pigmentasi), flavonol (seperti quersetin), isoflavon ( genistein dan diadzein), flavanol (catechin), dan proantosianidin. Flavonoid utama yang terkandung di dalam coklat adalah catechin, epicatechin, dan procyanidin.

Senyawa ini memiliki kemampuan sebagai antioksidan dengan cara menangkap radikal bebas yang terdapat di dalam tubuh. Selain itu flavonoid juga dapat membentuk khelat redoks dengan ion logam yang aktif. Berdasarkan penelitian, flavonoid terbukti dapat mengurangi resiko terkena penyakit jantung koroner, menginhibisi oksidasi kolesterol LDL, dan berperan di dalam sistem imun tubuh.

Gambar 2.7 kerangka dasar flavonoid

Gambar 2.8 Berbagai senyawa turunan flavonoid

2.3 Kolesterol dan Kesehatan

Kolesterol ialah sejenis lemak putih yang berbentuk kristal padat yang sangat dibutuhkan oleh tubuh. Kolesterol selalu terdapat pada sel hewan dan manusia, tetapi tidak terdapat pada tumbuhan. Kolesterol bisa terdapat dalam keadaan bebas atau terikat sebagai ester dari asam-asam lemak di dalam sel, terutama di otak, sumsum tulang belakang, darah, dan empedu. Secara kimia, kolesterol adalah sterol yang terdiri dari cincin fenantren jenuh yang mengikat delapan atom karbon pada rantai samping dengan gugus metil.

Kolesterol di dalam tubuh berasal dari makanan dan dari hasil sintesis tubuh sendiri. Makanan yang dianggap sebagai sumber kolesterol adalah kuning telur, yang mengandung lebih dari 275 mg kolesterol per butir, otak sapi yang mengandung 2000 mg/100 gr. Sedangkan daging, mentega, ikan, dan keju mengandung kolesterol sekitar 400 mg/100 gr. Kolesterol yang diproduksi oleh tubuh merupakan sintesis dari makanan, terutama yang mengandung karbohidrat. Setiap sel di dalam tubuh dibungkus dengan selaput pelindung yang sebagian terdiri dari kolesterol. Sehingga kolesterol ini sangat penting untuk tubuh, maka tubuh kita memproduksinya agar kebutuhan tubuh selalu terpenuhi.

Semua makanan yang berasal dari hewan mengandung kolesterol karena hewan sendiri sanggup memproduksi kolesterol. Sebaliknya, semua makanan nabati bebas dari kolesterol. Kolesterol terdiri dari senyawa lipid atau lemak yang tak larut dalam air, sehingga tidak dapat bercampur dengan air. Sebaliknya, darah terdiri dari banyak cairan. Agar kolesterol dapat dapat diangkut melalui peredaran darah, maka tubuh harus membungkus kolesterol di dalam protein yang disebut lipoprotein. Lipoprotein ini mengelilingi kolesterol dan memproteksinya dari darah. Lipoprotein mengapung dalam peredaran darah untuk membawa kolesterol ke bagian tubuh yang lain.

Lipoprotein yang mengangkut kolesterol ada dua jenis, yaitu Low Density Lipoprotein (LDL) dan High Density Lipoprotein (HDL). Kolesterol HDL bertindak sebagai pembersih dan pengangkut semua kelebihan kolesterol dari pembuluh darah. Kadar kolesterol HDL yang tinggi di dalam darah akan mengurangi resiko penyakit jantung koroner. Kolesterol HDL dikenal dengan sebutan kolesterol ‘baik’. Sedangkan kolesterol LDL akan mengangkut kolesterol dan lemak lain dan membawanya ke dalam  sel. Kolesterol LDL ini dikenal sebagai kolesterol ‘buruk’ karena membawa kolesterol ke dalam pembuluh darah. Sehingga kadar kolesterol yang tinggi di dalam darah akan meningkatkan resiko terkena atherosclerosis dan penyakit jantung koroner.

2.4 Antioksidan

Antioksidan merupakan suatu substansi yang membantu mencegah atau mengurangi kerusakan oksidatif akibat oksigen atau nitrogen yang reaktif. Kerusakan akibat oksidasi terhadap tubuh, sel, dan jaringan dapat berkontribusi pada munculnya penyakit seperti kanker dan jantung. Antioksidan di dalam peredaran darah dapat membantu mengeliminasi radikal bebas tersebut. Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil (mempunyai satu elektron atau lebih yang tanpa pasangan), sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan. Senyawa radikal bebas tersebut timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernapas, metabolisme sel, olahraga yang berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan seperti asap kendaraan bermotor, asap rokok, bahan pencemar, dan radiasi matahari atau radiasi kosmis. Buah-buahan, sayuran, dan kacang-kacangan memiliki sifat sebagai antioksidan. Flavonoid dan phytochemical, ditemukan pada tanaman tradisional, juga bersifat sebagai antioksidan.

Berikut adalah cara kerja antioksidan di dalam tubuh:

1.      Secara teori Lewis, atom oksigen yang stabil memiliki empat pasang elektron. Metabolisme tubuh kita dapat merampas elektron atom oksigen itu sehingga atom ini berubah menjadi radikal bebas. Tentu saja atom oksigen mempunyai kecenderungan untuk memperoleh kembali (atau mendapat ganti) elektron yang terampas tadi, dengan jalan membajak elektron dari molekul apapun yang ditemukan.

2.      Jika radikal bebas tersebut  kemudian merampas satu elektron dari molekul yang    ada pada  dinding sel, maka terbentuklah radikal bebas yang baru. Hal inilah yang menyebabkan munculnya reaksi berantai.

3.      Reaksi berantai yang dilakukan oleh oksigen tersebut akan merusak membran sel, dan menimbulkan kehancuran sampai terbentuk lubang yang dapat  dimasuki oleh benih kanker dan kuman penyakit lain.

4.          Karena susunan molekulnya, suatu senyawa antioksidan dapat memberi elektron dengan cuma-cuma kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu sama sekali. Molekul antioksidan ini akan memutuskan reaksi berantai yang  berbahaya tersebut. Dalam reaksi radikal dikenal dengan sebutan reaksi terminasi.

Dua jenis antioksidan yang digunakan dalam produk pangan adalah antioksidan alami dan sintetis. Vitamin E adalah antioksidan alami paling terkenal dan terdapat dalam jumlah yang cukup dalam seluruh minyak nabati. Antioksidan alami lain yakni sesamol dan gosipol, terdapat dalam minyak wijen dan minyak biji kapas. Pala dan paprika juga mengandung senyawa dengan aktivitas sebagai antioksidan. Sedangkan jenis antioksidan sintetis yang pada umumnya digunakan dalam produk pangan adalah BHA (butylated hidroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluen), PG (propil galat) dan TBHQ (tert-butylhydoxynisole).

2.5 Peroksidasi Lipid

Peroksidasi lipid dapat didefinisikan sebagai reaksi pengurangan oksidatif dari molekul lipid, terutama dalam hal pengurangan ikatan rangkap dari karbon. Penelitian tentang peroksidasi lipid ini pertama kali dikemukakan oleh seorang chemist dari Swiss yang bernama Nicolas-Théodore de Saussure pada sekitar tahun 1800 menggunakan manometer sederhana yang terbuat dari merkuri.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

Analisis Lipid dan Lipoprotein dalam serum serum

3.1 Diagram Global Penelitian

 

Suplementasi klinis

 

Gambar 3.1 Diagram global penelitian

3.2 Subjek Penelitian

Pada penelitian ini, yang menjadi subjek penelitian adalah 45 orang sukarelawan yang sehat dan bukan perokok. Sukarelawan ini terdiri atas pria (n=12) dan wanita (n=33) dengan umur rata-rata 26 tahun (batas umur antara 19-49 tahun). Sukarelawan ini berasal dari daerah Kuopio di Finlandia bagian Timur. Penelitian ini sebelumnya diiklankan pada koran kampus dan juga dikirimkan melalui email di University of Kuopio. Sukarelawan ini diseleksi terlebih dahulu melalui wawancara dan harus memenuhi kriteria seperti berikut:

1.      Tidak mengalami obesitas (Body Mass Index/BMI < 32 kg/m²)

2.      Tidak secara reguler menggunakan obat-obatan atau suplemen yang mengandung antioksidan (β-Karoten, vitamin C atau E) atau yang komposisi lipid rendah

3.      Tidak terjangkit penyakit kronis seperti diabetes, CHD (Coronary Heart Disease), atau penyakit berat lainnya

4.      Bersedia untuk mengkonsumsi 75 gram coklat setiap harinya selama 3 minggu untuk keperluan analisis

Semua sukarelawan harus membaca dan menyetujui prosedur eksperimen yang akan dilakukan. Prosedur penelitian yang telah baku sudah disetujui oleh Research Ethics Commite, Hospital District of Northern Savo.

3.3 Desain Penelitian

Penelitian ini terdiri atas 3 minggu studi suplementasi klinik. Penelitian tidak dilakukan secara acak. Para sukarelawan dipersilahkan untuk memilih coklat yang ingin mereka makan sebanyak 75 gram setiap harinya. Ada 3 macam coklat yang dapat dipilih, yaitu white chocolate (kelompok WC), dark chocolate (kelompok DC), atau dark chocolate yang kaya akan polifenol kokoa (kelompok HPC). Dari 45 orang sukarelawan, 5 pria dan 10 wanita berada di kelompok WC, 3 pria dan 12 wanita berada di kelompok DC, serta 4 pria dan 11 wanita berada di kelompok HPC. Kandungan nutrisi yang terkandung dalam coklat yang diteliti ditunjukkan pada tabel 3.1. Asupan polifenol untuk setiap jenis coklat berbeda, pada kelompok WC jumlahnya kurang dari 1 mg, untuk kelompok DC 274 mg, sedangkan pada kelompok HPC adalah 418 mg.

Tabel 3.1 Kandungan nutrisi di dalam coklat yang diteliti

Nutrisi/100 g coklat	WC	DC	HPC
Energi (kkal)	560	515	560
Protein (g)	7.6	6.0	7.1
Karbohidrat (g)	53.0	46.0	53.4
Lemak(g)	35.0	33.0	35.7
Asam Miristik (14:0) (g)	1.0	0.4	0.5
Asam Palmitat (16:0) (g)	8.1	6.6	6.9
Asam Stearat (18:0) (g)	8.0	7.0	7.5
Asam Oleat (18:1n-9) (g)	8.8	7.6	8.0
Asam Linoleat (18:2n-6) (g)	1.2	0.9	1.0
Asam Linolenat (18:3n-3) (g)	0.1	0.1	0.1
Jumlah total Catechins (mg)	0.3	365.5	556.8
Catechins (mg)	0.0	25.2	99.2
Epicatechins (mg)	0.0	151.5	227.0
Gallocatechins (mg)	0.3	23.1	16.4
Epigallocatechins (mg)	0.0	3.2	11.9
Catechin gallates (mg)	0.0	7.7	9.4
Epicatechin gallates (mg)	0.0	0.5	0.6
Epigallocatehin gallates (mg)	0.0	46.2	43.7
Procyanidins (mg)	0.0	108.1	148.6

Coklat yang digunakan pada penelitian ini dibagi dalam 21 hari penyajian, dan sukarelawan diinstruksikan untuk mengkonsumsi per harinya 3 porsi. 1 minggu sebelum penelitian ini dilakukan, sukarelawan tidak diperkenankan meminum teh, anggur merah, kokoa, dan coklat jenis lain. Pelarangan ini juga berlaku selama periode penelitian. Sukarelawan juga harus menghindari penggunaan alkohol dan analgesik. Selain itu sukarelawan juga harus berlatih fisik 1 hari sebelum penelitian.

Kandungan nutrisi coklat dianalisis menggunakan Nutricia Software (version 2.5; Social Insurance Institution, Helsinki, Finland). Sampel darah dianalisis menggunakan tabung vakum Venoject (Terumo, Tokyo, Japan) setelah dibiarkan semalaman (10 jam). Semua pengukuran diambil pada awal sebelum penelitian dan di akhir periode 3 minggu suplementasi.

Berikut adalah tahap-tahap pekerjaan yang dilakukan oleh para sukarelawan:

1.      Sukarelawan diberikan informasi mengenai penelitian yang dilakukan

2.      Menyetujui dan menandatangani formulir perjanjian

3.      Sampel darah sukarelawan (melakukan puasa terlebih dahulu) dianalisis

4.      Melakukan konsultasi dengan ahli nutrisi untuk mengecek food record selama 4 hari 

5.      Memakan coklat selama 3 minggu periode penelitian

6.      Setelah 3 minggu periode penelitian, sampel darah dianalisis kembali

7.      Melakukan konsultasi kembali dengan ahli nutrisi untuk mengecek food record selama 4 hari

3.4 Analisis Lipid dan Lipoprotein dalam Serum

Kolesterol (Konelab, Espoo, Finlandia) dan trigeliserida (Roche Diagnostics, Mannheim, Jerman) di dalam serum darah ditentukan dengan menggunakan tes kolorimetri secara enzimatik. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi sampel darah diendapkan dengan menggunakan magnesium klorida dextran sulfat. Kemudian ditentukan konsentrasi kolesterol HDL. Sedangkan konsentrasi kolesterol LDL ditentukan melalui pengukuran konsentrasi kolesterol secara langsung (Konelab).

3.5 Analisis Asam Lemak LDL

Serum dan asam lemak LDL dianalisis setelah diekstraksi menggunakan kloroform-metanol dan metilasi menggunakan asam sulfat-metanol. Asam lemak yang telah termetilasi dianalisis menggunakan kromatografi gas (HP 5890; Hewlett-Packard, Palo alto, CA, USA) yang dilengkapi oleh Flame Ionization Detector (FID) dan kolom kapiler NB-351 (HNU-Nordion, Helsinki, Finlandia).

Untuk mengisolasi kolesterol LDL, sejumlah serum yang mengandung LDL diendapkan menggunakan bufer heparin. Endapan yang diperoleh diresuspensi menggunakan bufer fosfat-Saline (PBS), kemudian ditentukan konsentrasi kolesterol LDL di dalam serum. Sisa suspensi yang diperoleh kemudian ditentukan pula konsentrasi LDL-diena terkonjugasi dan asam lemak LDL. Jumlah asam lemak dan konsentrasi LDL di dalam serum diungkapkan dalam bentuk persentase jumlah total asam lemak.

Selain itu, dari serum ini pula ditentukan aktivitas dari berbagai senyawa seperti aspartat aminotransferase (ASAT), alanin aminotransferase (ALAT), γ-glutamiltransferase (γ-GT), dan kreatin menggunakan Clinical Chemistry Analyzer (Konelab).

3.6 Analisis Resistensi Lipid di dalam Serum terhadap Oksidasi

Analisis resistensi lipid ini telah dilakukan pada penelitian sebelumnya (Nyyssonen, K., et al., 1997). Serum darah dilarutkan dalam 0,02 mol/l PBS dengan pH 7,4 hingga konsentrasi akhir 0,67%. Kemudian 2 ml larutan tersebut ditambahkan 100 µL CuCl₂ 1 mmol/L. Penambahan CuCl₂  dilakukan untuk menginisiasi terjadinya oksidasi. Kemudian larutan dipanaskan pada temperatur 30°C. Selanjutnya ditentukan absorbansinya pada panjang gelombang 234 nm pada temperatur 30°C. Pengukuran absorban bertujuan untuk memonitor perubahan konformasi dari diena terkonjugasi. Pengukuran absorban dilakukan menggunakan Beckman DU-640i spectrophotometer (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) yang dilengkapi enam tempat pengukuran secara bersamaan yang otomatis.

3.7 Penentuan LDL-diena Terkonjugasi di dalam Serum

Prosedur analisis LDL-diena terkonjugasi ini telah dipubliksikan sebelumnya (Porkkala-Sarataho, E. K., et al., 1998). Endapan lipid yang diperoleh pada percobaan isolasi LDL sebelumnya diekstraksi menggunakan kloroform-metanol (3:1). Kemudian hasil ekstraksi dievaporasi menggunakan nitrogen. Hasil evaporasi ini dilarutkan dalam sikloheksan. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 234 nm dan 300 nm. Secara spektrofotometri akan diperoleh konsentrasi LDL-diena terkonjugasi.

3.8 Analisis Asam Lemak Hidroksi dalam Plasma

Asam lemak hidroksi C₁₈ diukur menggunakan kromatografi gas/spektrofotometri massa (Agilent Technologies, Espoo, Finlandia). Prosedur ini pun telah dipublikasikan sebelumnya (Kaikkonen, J., et al., 2004). Asam lemak plasma dan asam lemak hidroperoksida distabilkan dengan hidrogenasi menggunakan platinum sebagai katalis, saponifikasi, esterifikasi menggunakan diazometan. Untuk memisahkan asam lemak hidroksi dari asam lemak dilakukan ekstraksi fasa padat pada kolom mini. Analisis lebih diprioritaskan pada gugus hidroksi dimetilasi dan tetrametil amonium hidroksida. Konsentrasi asam lemak monohidroksi (OHFA) dan ester metil ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri massa Electron Impact (EI). Sebagai standar dalam digunakan  OHFA C₁₇ dan C₁₉.

3.9 Analisis F₂-Isoprostan dalam plasma

Prostaglandin F_2α sebagai standar dalam ditambahkan ke dalam plasma. Kemudian F₂-Isoprostan diekstraksi menggunakan C₁₈ dan mini kolom silika. Campuran yang diperoleh dikonversi menjadi pentafluorobenzil ester trimetilsilil dan dianalisis menggunakan kromatografi gas/spektrofotometri massa (Agilent Technologies).

3.10 Analisis Catechin dan Procyanidin pada Coklat

Metode yang sebelumnya pernah dipublikasikan adalah metode starting point (Arts, I. C. W., et al., 1998). Metode ini dilakukan dengan cara mengekstraksi catechin selama 1 jam menggunakan metanol (MeOH) 70-90% pada temperatur kamar atau 30 menit menggunakan 90% MeOH pada temperatur 90°C. Perbedaan kondisi ini disesuaikan dengan tipe sampel. Kita membandingkan kondisi ekstraksi menggunakan coklat yang berbeda. Pertama adalah coklat yang mengandung bubuk kokoa dan coklat yang lain tidak mengandung bubuk kokoa.

Pada percobaan ini digunakan variasi temperatur, yaitu antara temperatur kamar hingga 90°C dan juga waktu ekstraksi yang berbeda, yaitu antara 30 menit hingga dua jam. pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah 30-100% metanol atau asetonitril dan 0-1M asam hidroklorida (HCl). Kemudian dibandingkan hasilnya untuk menentukan kondisi yang terbaik bagi ekstraksi catechin.

Analisis catechin dilakukan menggunakan Kromatografi Cair Tingkat Tinggi (HPLC) yang dilengkapi detektor elektroda kolorimetri (ESA Inc., Chelmsford, MA., USA). Detektor ini terdiri dari delapan pasang elektroda pengukur pada dua tempat yang terpisah. Penentuan potensial dapat diatur terpisah untuk masing-masing elektroda. Potensial yang digunakan adalah antara 100 hingga 700 mV. Sinyal kuantifikasi untuk setiap catechin diperoleh pada chanel 5 dengan potensial 520 mV. Kolom analitik yang digunakan adalah inertsil C₁₈, 150x3 mm (GL Sciences, Tokyo, Japan). Fasa gerak yang digunakan terdiri dari dua eluen:

1.      50 mM bufer fosfat pH 2,3 dan MeOH dengan perbandingan 90:10 (v/v)

2.      50 mM bufer fosfat pH 2,3 dan MeOH-ACN dengan perbandingan 40:40:20 (v/v/v)

Analit dipisahkan dengan gradien elusi selama 40 menit. Waktu retensi yang digunakan adalah 0,3 ml/menit. Untuk analisis procyanidin digunakan HPLC pula.

Sebanyak 10-30 mg coklat ditimbang kemudian dimasukkan ke vial ekstraksi. Selanjutnya ditambahkan 2,5 ml MeOH 50% yang mengandung 0,1 M HCl. Sampel diinkubasi selama 2 jam pada temperatur 50°C. Setelah selesai inkubasi, sampel disentrifuga pada kecepatan 2400 rpm selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifuga dimasukkan ke tabung volumetri, kemudian ditambahkan MeOH 50%. Sampel dianalisis menggunakan HPLC. Analisis dilakukan secara triplo.

3.11 Analisis Statistik

Hasil percobaan diungkapkan dalam bentuk rata-rata (± standar deviasi). Perbedaan nilai pengukuran antara periode awal dan setelah periode 3 minggu suplementasi dibandingkan menggunakan t-test. Nilai rata-rata dibandingkan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Perbedaan nilai p=0,05 atau p<0,05 dianggap signifikan. Analisis korelasi sederhana dan regresi linier digunakan untuk memperkirakan perubahan formasi analisis diena terkonjugasi. Untuk analisis statistik ini memanfaatkan SPSS Software (version 10.0; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Analisis Lipid dan LDL

Semua sukarelawan telah selesai mengikuti semua tahap penelitian, dan tidak ditemukan hal-hal yang dapat merugikan sukarelawan. Hasil analisis secara keseluruhan dapat dilihat pada tabel 4.1.

Tabel 4.1 Penentuan BMI dan serum sebelum dan sesudah suplementasi

Parameter	WC              (n =15)		DC   (n = 15)		HPC        (n =15)		p
	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan
BMI (kg/m2)	22,3 ± 2,3	-0,4 ± 1,0	21,5 ±2,9	0,1 ± 0,2	24,1 ± 3,5	0,3 ± 0,3	0,012
Serum ASAT (U/l)	23 ± 7	-2 ± 7	22 ± 8	2 ± 12	20 ± 6	4 ± 9	0,230
Serum ALAT (U/l)	24 ± 13	-1 ± 15	17 ± 8	-2 ± 7	16 ± 9	4 ± 18	0,478
Serum γ-GT (U/l)	15 ± 7	0 ± 5	14 ± 6	-0 ± 3	18 ± 11	1 ± 7	0,741
Serum kreatin (µmol/l)	85 ± 11	0 ± 9	79 ± 7	1 ± 6	84 ± 11	2 ± 7	0,842
Serum total kolesterol  (mmol/l)	5,21 ± 0,72	-0,02 ± 0,51	4,74 ± 0,90	0,08 ± 0,49	4,99 ± 1,01	0,12 ± 0,47	0,710
Kolesterol LDL dalam serum (mmol/l)	2,80 ± 0,57	0,17 ± 0,6	2,57 ± 0,68	0,00 ± 0,37	2,82 ± 0,62	0,00 ± 0,39	0,627
Kolesterol HDL dalam serum (mmol/l)	1,49 ± 0,32	-0,00 ± 0,14	1,41 ± 0,38	0,14 ± 0,15	1,38 ± 0,29	0,18 ± 0,12	<0,001
Perbandingan LDL/HDL dalam serum	1,98 ± 0,66	-0,17 ± 0,42	1,96 ± 0,89	-0,19 ± 0,33	2,08 ± 0,53	-0,20 ± 0,36	0,013
Trigliserida dalam serum (mmol/l)	1,45 ± 0,74	-0,15 ± 0,59	1,12 ± 0,55	-0,21 ± 0,46	0,95 ± 0,35	0,00 ± 0,49	0,336
TRAP dalam plasma (µmol/l)	1057 ± 206	22 ± 134	973 ± 176	85,1 ± 250	1155 ± 170	91,5 ± 229	0,657
Resistensi lipid terhadap oksidasi (waktu lag, menit)	118 ± 43	6 ± 31	122 ± 35	4 ± 32	160 ± 61	-3 ± 28	0,711
LDL-diena terkonjugasi (µmol/mmol kolesterol)	16,3 ± 3,1	-4,0 ± 6,9	16,7 ± 2,6	-5,9 ± 7,6	15,5 ± 2,7	-4,6 ± 5,7	0,496
F2-isoprostanes dalam plasma(pg/ml)	43,4 ±13,8	-2,5 ± 7,9	48,7 ± 22,0	-5,3 ± 15,9	45,4 ± 11,2	-0,9 ± 8,1	0,554

Selama penelitian ini, rata-rata berat badan sukarelawan menurun untuk kelompok WC (-1,1 ± 2,7 kg) dan meningkat sedikit untuk kelompok DC (0,4 ± 0,7 kg) juga untuk kelompok HPC (0,8 ± 0,9 kg). Selama penelitian pula, total energi meningkat dan proporsi lemak meningkat, sedangkan proporsi protein dan karbohidrat menurun. Nutrisi yang masuk adalah sama untuk setiap kelompok, hal ini ditunjukkan pada tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil Food Record selama 4 hari

Nutrisi per hari	WC (n=15)		DC (n=15)		HPC (n=15)		p
	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan
Energi (MJ/hari)	7,9 ± 1,4	1,8 ± 1,2	7,9 ± 1,6	1,3 ± 1,5	8,1 ± 1,5	1,9 ± 2,6	0,666
Protein (%E)	15,3 ± 2,7	-2,3 ± 2,1	15,2 ± 2,8	-2,0 ± 2,0	16,1 ± 2,5	-2,5 ± 1,9	0,792
Karbohidrat (%E)	52,8 ± 4,3	-4,1 ± 4,3	51,7 ± 7,3	-5,1 ± 5,5	51,5 ± 9,4	-3,9 ± 5,8	0,781
Total Lemak (%E)	30,5 ± 4,4	5,9 ± 4,2	32,8 ± 6,0	5,3 ± 4,8	31,4 ± 7,3	6,0 ± 6,6	0,924
SAFAs (%E)	12,2 ± 2,4	3,6 ± 2,5	13,9 ± 3,2	2,1 ± 2,4	11,9 ± 2,4	2,8 ± 2,6	0,304
MUFAs (%E)	10,1 ± 1,6	0,6 ± 1,7	10,4 ± 2,2	0,5 ± 2,0	11,0 ± 3,5	-0,6 ± 3,0	0,305
PUFAs (%E)	5,3 ± 1,7	-0,9 ± 1,8	4,7 ± 1,3	-0,6 ± 1,2	5,4 ± 2,0	-0,9 ± 2,2	0,850
Serat (gr)	19,9 ± 4,9	3,8 ± 4,2	24,4 ± 11,0	2,5 ± 5,7	23,5 ± 10,0	3,4 ± 5,8	0,787
Vit E (mg)	8,6 ± 2,2	0,3 ± 2,8	8,7 ± 3,3	-0,4 ± 1,9	9,3 ± 3,6	-0,9 ± 3,3	0,509
Vit C (mg)	116 ± 79	13,4 ± 72,1	143 ± 63	-42,7 ± 76,9	154 ± 122	-8,0 ± 120,8	0,257
Beta karoten (µg)	3136 ± 1985	-1109 ± 2731	2381 ± 1494	143 ± 1995	3069 ± 2082	-407 ±1566	0,290
Folat (µg)	247 ± 73	0,4 ± 62,7	272 ± 70	-35,4 ± 70,6	265 ± 94	-1,7 ± 79,5	0,312

Secara keseluruhan, penelitian ini berjalan lancar. Setiap instruksi dilakukan dengan baik oleh setiap sukarelawan. Setiap sukarelawan tidak dibolehkan untuk mengkonsumsi teh, anggur merah, kokoa, dan coklat lain selain coklat yang digunakan pada penelitian.

Selama periode suplementasi, proporsi asam stearat (18:0) dan asam linoleat (18:2n-6) di dalam serum meningkat. Sedangkan proporsi asam miristat (14:0), asam palmitat (16:0) dan asam α-Linolenat (18:2n-3) di dalam serum menurun. Perubahan proporsi asam miristat di dalam serum berbeda cukup signifikan antara kelompok WC dan HPC. Namun, untuk asam lemak lain di dalam serum tidak ada perbedaan yang berarti antara ketiga kelompok.

Di dalam kolesterol LDL, proporsi asam stearat meningkat, sedangkan asam miristat, asam palmitat, asam α-Linolenat, dan asam arakidonat menurun (Tabel 4.3). Perubahan proporsi asam miristat di dalam kolesterol LDL antara kelompok DC dan HPC cukup berbeda. Sedangkan perubahan proporsi asam arakidonat secara statistik berbeda antara kelompok WC dan HPC.

Tabel 4.3 Presentase asam lemak dalam jumlah total asam lemak dalam serum dan LDL sebelum dan sesudah suplementasi

Asam Lemak	WC (n=15)		DC (n=15)		HPC (n=15)		p
	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan	Awal	Perubahan
Asam lemak dalam serum
Myristic acid (14:0)	1,8 ± 0,7	-0,4 ± 0,7	1,7 ± 0,5	-0,4 ± 0,4	1,4 ± 0,3	-0,0 ± 0,4	0,037
Palmitic acid (16:0)	26,2 ± 1,4	-0,9 ± 1,3	25,4 ± 2,6	-0,8 ± 1,1	25,0 ± 1,1	0,0 ± 1,4	0,103
Stearic acid (18:0)	6,5 ± 0,5	0,8 ± 0,6	6,7 ± 0,7	0,7 ± 0,8	6,6 ± 0,6	0,8 ± 0,5	0,631
Oleic acid (18:1n-9)	22,7 ± 2,0	0,0 ± 1,9	22,2 ± 2,3	-0,5 ± 2,1	21,8 ± 2,3	0,0 ± 2,1	0,762
Linoleic acid (18:2n-6)	25,5 ± 2,1	1,3 ± 2,0	27,0 ± 4,0	1,5 ± 2,2	27,7 ± 2,3	0,3 ± 2,8	0,307
Asam lemak dalam LDL
Myristic acid (14:0)	2,1 ± 0,7	-0,4 ± 0,7	2,4 ± 1,1	-0,6 ± 0,6	1,9 ± 0,7	0,1 ± 0,4	0,016
Palmitic acid (16:0)	24,5 ± 1,4	-0.8 ± 1,9	24,3 ± 2,3	-0,9 ± 1,8	23,0 ± 1,3	0,3 ± 1,7	0,156
Stearic acid (18:0)	4,9 ± 0,6	0,7 ± 0,6	5,0 ± 0,6	0,6 ± 0,5	4,9 ± 0,6	0,8 ± 0,7	0,735
Oleic acid (18:1n-9)	24,9 ± 2,2	-0,2 ± 2,0	24,0 ± 3,0	-0,1 ± 2,4	23,5 ± 2,2	0,6 ± 2,0	0,551
Linoleic acid (18:2n-6)	27,5 ± 2,7	1,4 ± 2,9	28,3 ± 4,4	1,8 ± 2,6	30,2 ± 2,6	-0,4 ± 3,2	0,105

4.2  Hasil Analisis HDL dan Peroksidasi Lipid

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kolesterol HDL di dalam serum meningkat untuk kelompok DC dan HPC (11,4% dan 13,7% berturut-turut), sedangkan untuk kelompok WC mengalami penurunan sebesar 2,9%. Untuk perbandingan kolesterol LDL/HDL nilainya meningkat pada kelompok WC (0,17 ± 0,42) tetapi  menurun untuk kelompok DC dan HPC (-0,19 ± 0,33 dan -0,20 ± 0,36 berturut-turut). Hasil percobaan tidak menunjukkan perubahan yang berarti pada jumlah total serum, kolesterol LDL, dan konsentrasi trigliserida untuk semua kelompok penelitian.

Untuk melihat penurunan peroksidasi lipid akibat konsumsi coklat dapat ditentukan melalui perubahan formasi diena terkonjugasi. Hasil percobaan menunjukkan bahwa terjadi penurunan yang signifikan dari jumlah diena terkonjugasi sebesar rata-rata 11,9% (p< 0,001) untuk semua kelompok.

4.3  Hasil Analisis Catechin pada Coklat

Coklat merupakan makanan yang mengandung berbagai macam senyawa polifenol yang bervariasi terutama catechin yang secara intensif dipelajari pada penelitian ini dalam hubungannya dengan kemungkinan berefek pada kesehatan. Catechin di alam berada dalam bentuk aglikon, tetapi dapat mengalami polimerisasi menjadi struktur oligomerik. Di dalam coklat, senyawa catechin ini berbentuk monomernya (de Pascual-Teresa, S., et al., 2000) dan dalam bentuk oligomerik seperti di-, tri-, dan tetramer (Natsume, M., et al., 2000). Catechin merupakan senyawa yang labil dan reaktif yang mudah terdekomposisi pada temperatur tinggi dan pada kondisi sangat asam atau sangat basa. Sehingga tes ekstraksi dilakukan pada berbagai kondisi. Catechin lebih stabil pada kondisi asam yang lemah, sehingga harus ditentukan efek dari penambahan HCl.

Efisiensi ekstraksi catechin dari coklat sangat bergantung pada temperatur yang digunakan. Efisiensi ekstraksi meningkat signifikan ketika temperaturnya cukup tinggi untuk melelehkan coklat. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kondisi terbaik untuk mengekstraksi catechin dari coklat adalah 2 jam ekstraksi pada temperatur 50°C dengan menggunakan 50% MeOH yang mengandung 0,1 M HCl. Pada kondisi seperti ini, campuran tidak terdekomposisi dan kuantitas catechin yang diperoleh paling tinggi.

Hasil analisis sampel coklat menggunakan HPLC menunjukkan bahwa pada WC mengandung catechin dalam jumlah yang tidak terlalu signifikan. Pada DC mengandung 2,6 mg/gr monomer catechin. Jumlah yang paling banyak adalah epicatechin sebesar 60% dari total catechin secara keseluruhan. Sedangkan HPC mengandung 4,1 mg/gr monomer catechin. Dapat dilihat bahwa penambahan ekstrak kokoa dapat meningkatkan jumlah catechin di dalam coklat terutama epicatechin.

4.4 Konsumsi Coklat dan Kolesterol HDL

Konsentrasi kolesterol HDL di dalam serum dan modifikasi oksidatif LDL memegang peranan penting di dalam patogenesis dan atherosklerosis (Steinberg, D., et al., 1989 dan Salonen, J. T., et al., 1992). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa konsumsi kokoa atau coklat dapat memberikan efek yang bermanfaat pada manusia dalam hal patogenesis dan atherosklerosis. Mengkonsumsi dark chocolate dan kokoa dapat meningkatkan konsentrasi kolesterol HDL (Wan, Y., et al., 2001) dan kapasitas antioksidan dalam plasma (Serafini, M., et al., 2003 dan Rein, D., et al., 2000) serta dapat menginhibisi oksidasi LDL secara ex vivo (Kondo, K., et al., 1996 dan Mathur, S., et al., 2002), tetapi dapat menurunkan formasi produk hasil oksidasi lipid (Wang, J.F., et al., 2000). Hal yang menjadi objek utama dalam percobaan klinis adalah untuk mempelajari efek jangka panjang mengkonsumsi coklat terhadap lipid di dalam serum dan oksidasi lipid secara ex vivo atau in vivo. Namun, berbeda dengan penelitian sebelumnya, penelitian ini difokuskan pada jumlah kokoa yang berbeda tetapi jumlah asam lemaknya sama. Hal ini bertujuan untuk mempelajari efek polifenol dari asam lemak tersebut.

Hasil percobaan ternyata menunjukkan bahwa dengan mengkonsumsi coklat dalam jangka waktu lama tidak berpengaruh pada jumlah asam lemak di dalam serum dan juga pada LDL. Pada penelitian ini, dua asam lemak jenuh (asam palmitat dan asam stearat) dihitung lebih dari 90% pada jumlah total asam lemak. Yang menarik adalah hanya satu proporsi asam stearat yang meningkat, sedangkan proporsi asam palmitat menurun baik pada serum maupun LDL.

Selain asam stearat dan asam oleat, asam palmitat juga merupakan prekursor di dalam perpanjangan rantai jenuh dan tak jenuh pada asam lemak. Lebih lanjut lagi, asam oleat digunakan sebagai prekursor pada reaksi elongasi asam lemak jenuh. Sebagai informasi, hingga saat ini belum ada penelitian yang melaporkan efek konsumsi coklat terhadap kandungan asam lemak di dalam serum atau LDL. Namun di lain pihak, telah diketahui secara luas bahwa ada hubungan yang erat antara lipogenesis hati dengan konsentrasi serum yang bebas asam lemak (Murray, R.K., et al., 1993). Dengan demikian, pemasukan nutrisi ke dalam tubuh dapat menekan sintesis asam lemak di dalam hati.

Hal yang paling penting dari penelitian ini adalah hasil percobaan yang menunjukkan bahwa konsentrasi kolesterol HDL meningkat untuk dua kelompok yang mengkonsumsi coklat yang mengandung kokoa. Konsentrasi kolesterol HDL meningkat 11% setelah mengkonsumsi dark chocolate dan 14% setelah mengkonsumsi dark chocolate yang kaya akan polifenol. Sedangkan konsumsi white chocolate tidak memberikan efek pada jumlah kolesterol HDL. Sehingga perbandingan LDL/HDL juga berubah dengan kecenderungan yang sama. Yang memiliki tanggung jwb terhadap peningkatan kolesterol HDL adalah kokoa karena kandungan asam lemak yang digunakan identik. Kokoa mengandung campuran senyawa yang bervariasi seperti polifenol (flavan-3-ols, flavanols), sterol, di- dan triterpen, alkohol alifatik, dan metilxantin (Knight, I., et al., 2000). Suatu hal yang sangat sulit untuk menentukan secara tepat senyawa dalam kokoa apa yang memiliki efek terhadap perubahan konsentrasi HDL. Pada penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa suplementasi flavanoid selain dari coklat tidak meningkatkan konsentrasi HDL.

Data yang diperoleh pada penelitian ini (difokuskan pada HDL) juga didukung oleh penelitian lain dewasa ini. Pada penelitian sebelumnya (Wan, Y., et al., 2001) diperoleh data bahwa konsumsi 22 gram bubuk kokoa dan 16 gram dark chocolate selama empat minggu akan meningkatkan konsentrasi kolesterol HDL sebesar 4%. Sedangkan pada penelitian ini, konsumsi 75 gram coklat selama tiga minggu akan meningkatkan HDL sebesar 11-14%.

Seperti yang telah diketahui, bahwa konsentrasi tinggi kolesterol HDL dapat menurunkan resiko seseorang untuk terkena cardiovascular diseases (Castelli, W. B., et al., 1986). Dengan mengubah gaya hidup, biasanya konsentrasi kolesterol HDL dapat meningkat sebesar 10-15%. Namun strategi ini tidak selalu sesuai untuk setiap orang, contohnya untuk orang yang giat olahraga atau alkoholik, membutuhkan tingkat konsentrasi kolesterol HDL yang lebih tinggi (Safeer, R. S., et al., 2000). Sehingga, untuk penelitian selanjutnya harus mengidentifikasi campuran senyawa pada kokoa yang dapat meningkatkan HDL.

4.5 Konsumsi Coklat dapat Menginhibisi Peroksidasi Lipid      

Data selanjutnya yang diperoleh pada penelitian ini adalah mengenai konsumsi coklat yang dapat menginhibisi proses oksidasi LDL in vivo secara signifikan, seperti yang diukur pada formasi diena terkonjugasi. Metode yang digunakan untuk melihat perubahan formasi diena terkonjugasi adalah yang paling terbaru. Penurunan peroksidasi lipid pada semua kelompok menunjukkan efek yang disebabkan oleh adanya asam lemak di dalam coklat. Pada penelitian sebelumnya telah dilaporkan hubungan antara asam lemak tak jenuh ganda dan asam lemak jenuh tunggal dapat menginhibisi peroksidasi lipid (Eritsland, J, 2000). Konsumsi lemak jenuh atau lemak tak jenuh dalam bentuk coklat dapat memodifikasi kandungan lipid dari LDL, sehingga memungkinkan LDL resistan terhadap proses oksidasi akibat meningkatnya jumlah lemak tak jenuh tunggal dan lemak jenuh serta menurunnya lemak tak jenuh ganda pada asam lemak.

Meskipun hasil penelitian ini menunjukkan konsumsi coklat memberikan efek pada diena terkonjugasi LDL secara in vivo, tetapi tidak dapat ditunjukkan efek pada penanda lain untuk peroksidasi lipid. Formasi diena terkonjugasi merupakan langkah awal di dalam formasi oksidasi asam lemak (Gutteridge, J.M.C., et al., 1994). Suatu hal yang sangat mungkin bahwa efek awal dari antioksidan dapat diperkirakan dengan cara mengukur konsentrasi diena secara in vivo. Hal inilah yang menyebabkan pengukuran diena terkonjugasi secara in vivo lebih sensitif untuk pengukuran peroksidasi lipid dibanding pengukuran dengan metode lainnya.

Hasil penelitian tidak menunjukkan bahwa polifenol dalam kokoa dapat menginhibisi peroksidasi lipid pada manusia. Hal ini bertentangan dengan hasil penelitian sebelumnya. Bolus tunggal kokoa atau coklat menunjukkan dapat meningkatkan kapasitas antioksidan di dalam plasma (Serafini, M., et al., 2003), menurunkan formasi produk oksidasi lipid (Rein, D., et al., 2000), dan menginhibisi oksidasi LDL secara ex vivo (Kondo, K., et al., 1996), setidaknya selama beberapa jam.

Efek yang bermanfaat diperoleh dari senyawa polifenol dalam kokoa, meskipun, pada penelitian ini studi suplemen dilakukan untuk jumlah polifenol dan asam lemak yang berbeda. Sangatlah memungkinkan bahwa lemak tak jenuh dan lemak jenuh dalam kokoa atau coklat bertanggung jawab untuk menginhibisi peroksidasi lipid.

Hasil penelitian sebelumnya menyarankan metodologi ex vivo seperti F₂-isoprostan dipertimbangkan sebagai marker untuk peroksidasi lipid dalam tubuh manusia (Halliwell, 2000). Konsumsi bolus tunggal atau konsumsi coklat jangka panjang tidak berpengaruh terhadap formasi isoprostan (Mathur, S., et al., 2002). Kita tidak dapat memprediksikan kemungkinan polifenol di dalam kokoa dapat menginhibisi peroksidasi lipid dan juga meningkatkan stres oksidatif. Tingkat peroksidasi lipid pada orang muda lebih rendah dibandingkan pada orang yang umurnya lebih tua (Spiteller, G., 2001).  

Desain penelitian ini tidaklah kemungkinan yang terbaik untuk mempelajari efek asam lemak di dalam coklat dalam hubungannya dengan peroksidasi lipid. Misalnya adalah penggunaan jumlah asam lemak yang berbeda tetapi jumlah total lemak di dalam coklat sama, dan sebagai kontrolnya adalah coklat tanpa asam lemak. Sehingga tidak sepenuhnya mancakup kemungkinan faktor lain selain asam lemak dalam coklat terhadap peroksidasi lipid.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Senyawa polifenol di dalam kokoa atau coklat dapat meningkatkan konsentrasi kolesterol HDL di dalam tubuh manusia. Selain itu, polifenol ini juga digunakan sebagai marker pada peroksidasi lipid. Tetapi polifenol di dalam kokoa tidak dapat menginhibisi peroksidasi lipid pada orang muda yang sehat. Peroksidasi lipid dapat diinhibisi oleh asam lemak yang ada pada coklat.

5.2 Saran

• Mengidentifikasi lebih lanjut penelitian tentang peningkatan konsentrasi kolesterol HDL
• Mempelajari efek konsumsi coklat terhadap resiko CVD (Cardiovaskular Disease), seperti fungsi endothelial dan faktor trombogenik.

DAFTAR PUSTAKA

Arts, I. C. W., Hollman, P. C. H. Optimation of a Quantitative Method for the Determination of Catechins in Fruits and Legumes. J. Agric. Food Chem. 46: 5156-5162, 1998.

Castelli W. P., Garrison R. J., Wilson P. W., Abbot R. D., Kalousdian W. B. Insidence of Coronary Heart Disease and Lipoprotein Cholesterol Level. The Framingham Study. 256: 2835-2838, 1986.

Denke, M. A. Effects of cocoa Butter on Serum Lipids in humans: Historical Highlights. Am. J. Clin. Nutr. 60, 1994.

 De Pascual-Teresa, S., Santos Buelga, C., Rivas G. J. C. Quantitative Analysis of Flavan-3-ols in Spanish Foodstuffs and Beverages. J. Agric. Food Chem. 48: 5331-5337, 2000.

Eritsland, J. Safety Considerations of Polyunsaturated Fatty Acids. Am. J. Clin. Nutr. 71: 197-201, 2000.

Fuhrman, B., Aviram, M. Flavonoids Protect LDL from Oxidation and Attenuate Atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol. 12: 41-48, 2001.

Gregory, J. The Dietary and Nutritional Survey of British Adults, 1990.

Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants in Nutrition, Health, and Disease. New York: Oxford University Press, 1994.

Halliwell, B. Lipid Peroxidation, Antioxidants and Cardiovascular Disease: How should we more forward? Cardiovasc, Res. 47: 410-418, 2000.

Hertog, M. G. L., Kromhout, D., Aravanis, C., Blackburn, H., Buzina, R., Fidanza, F., Giampaoli, S., Jansen, A., Menotti, A. Flavonoid Intake and Longterm Risk of CHD and Cancer in the Seven Countries Study. Arch. Intern. Med. 155: 381-386, 1995.

Kaikkonen, J., Tuomainen, T. P., Nyssonen, K., Morrow, J. D., Salonen, J. T. C18 Hydroxy Fatty Acids as Markers of Lipid Peroxidation ex vivo and in vivo. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 64: 1-11, 2004.

Knight, I., ed. Chocolate and Cocoa: Health and Nutrition. Oxford: Blackwell Science Ltd, 2000.

Kris-Etherton, P. M., Mustad, V. A. Chocolate feedings studies: a Novel Approach for Evaluating the Plasma Lipid effect of Stearic Acid. Am. J. Clin. Nutr. 60: 1029-1036, 1994.

 Kondo, K., Hirano, R., Matsumoto, A., Igarashi, O., Itakur, H. Inhibition of LDL Oxidation by Cocoa. Lancet 348: 1514, 1996.

Mathur, S., Devaraj, S., Grundy, S. M., Jialal, I. Cocoa Products decrease Low Density Lipoprotein Oxidative Suspectibility But Do Not Affect Biomarkers of Imflamantation in Humans. J. nutr. 132: 3663-3667, 2002.

Murray, R. K., Granner, D. K., Mayers, P. A., Rodwell, V. W., Abbot, R. D., Kalousdian, W. B. Kannel, Incidence of Coronary Heart Disesase and Lipoprotein Cholesterol Level. The Framingham Study. JAMA. 256: 2835-2838, 1986.

Natsume, M., Osakabe, N., Yamagishi, M., Takizawa, T., Nakamura, T., Miyatake, H., Hatano, T., Yoshida, T. Analysis of Polyphenols in Cacao Liquor, Cocoa and Chocolate by Normal-phase and Reverse-phase HPLC. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:2581-2587, 2000.

Nyyssonen, K., Porkkala-Saratho, E., Kaikkonen, J., Salonen, J. T. Ascorbate and Urate are Strongest Determinants of Plasma Antioxidative Capacity and Serum Lipid Resistance to Oxidation in Finnish men. Atherosclerosis. 130: 223-233, 1997.

 Porkkala-Saratho, E. K., Nyyssonen, K. M., Kaikkonen, J. E., Poulsen, H. E., Hayn, E. M., Salonen, R. M., Salonen, J. T. A. Randomized, Single-blind, placebo Controlled Trial of the Effects of 200 mg a-tocopherol on the Oxidation Resistance of Atherogenic Lipoprotein. Am. J. Clin. Nutr. 68: 1034-1041, 1998.

Rein, D., Lotito, S., Holt, R. R., keen, C. L., Schmitz, H. H., Fraga, C. G. Epicatechin in Human Plasma: in vivo Determination and Effect of Chocolate Consumption on Plasma Oxidation Status. J. Nutr. 130: 2109-2114, 2000.

Safeer, R. S., cornell, M. O. The Emerging Role of HDL Cholesterol. Postgard. Med. 108: 87-90, 93-98, 2000.

Scalbert, A., Williamson, G. Dietary Intake and Bioavailability of Polyphenols. J. Nutr. 130: 2089-2092, 2000.

Serafini, M., Bugianesi, R., Maiani, G., Valtuena, S., DeSantis, S., Crozier, A. Plasma Antioxidants from Chocolate. Nature. 424: 1013, 2003.

Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, T. E., Witztum, J. L. Modifications of Low-Density Lipoprotein that Increase its Atherogenecity, N. Engl. J. Med. 320: 915-924, 1989.

Wang, J. F., Schramm. D. D., Holt, R. R., Ensunsa, J. L., Fraga, C. G., Schmitz, H. H., Keen, C. L. A. A Dose-dependent Effect from Chocolate Consumption on Plasma Epicatechin and Oxidative Damage. J. Nutr. 130:2115-2119, 2000.

Wan, Y., Vinson, J. A., Etherton, T. D., Proch, J., Lazarus, S. A., Kris-Etherton, P. M. Effects of Cocoa Powder and Dark Chocolate on LDL Oxidative Suspectibility and Prostaglandin Concentrations in Humans. Am. J. cli. Nutr. 74: 596-602, 2001.